Kỹ thuật PCR phần 1
Thuật ngữ PCR là viết tắt của “Polymerase-Chain-Reaction”, đây là một phản ứng nhân bản DNA dựa trên các chu kỳ nhiệt. Bài viết này nhằm giới thiệu các thông tin quan trọng về kỹ thuật PCR cũng như các vấn đề thường gặp khi sử dụng kỹ thuật này.
KỸ THUẬT PCR LÀ GÌ?
Thuật ngữ PCR chỉ một phản ứng nhân bản DNA dựa trên các chu kỳ nhiệt. Phản ứng diễn ra trong một ống nghiệm nhỏ chứa dung dịch phản ứng (gọi là PCR mix). Trong PCR mix sẽ chứa các thành phần:
1) Polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase), enzyme này có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 72 oC.
2) 4 loại nucleotide (dNTP) gồm: dATP/dTTP/dGTP/dCTP là nguyên liệu để tổng hợp ra các bản sao DNA.
3) DNA chứa trình tự mục tiêu (Template): Thông thường trong xét nghiệm thì đây là DNA thu nhận từ mẫu cần xét nghiệm.
4) Cặp mồi đặc hiệu (Primer): Đây là các đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 20 nucleotide và bắt cặp bổ sung đặc hiệu cho 2 đầu trình tự mục tiêu cần nhân bản.
5) Cation Mg2+ (MgCl2): đây là co-factor quan trọng để Taq polymerase hoạt động hiệu quả.
6) Dung dịch đệm Tris-KCl (PCR Buffer): Cung cấp môi trường thuận lợi cho phản ứng nhân bản diễn ra.
Ống nghiệm chứa PCR mix sẽ được đặt vào trong buồng ủ của máy luân nhiệt (Thermo cycler), ở Việt Nam thì thường gọi luôn là máy PCR. Nhiệt độ bên trong buồng ủ của máy PCR sẽ thay đổi theo chu kỳ, nhờ đó mà quá trình nhân bản DNA được diễn ra.
NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA PCR
Một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:
1 – Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94 oC, các liên kết hydro sẽ bị phá vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn.
2 – Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 – 65 oC, các đoạn mồi sẽ bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu.
3 – Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72 oC, Taq polymerase sẽ sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3′ của mồi và tạo ra mạch bổ sung.
Kỹ thuật PCR
Như vậy, cứ qua một chu kỳ nhiệt, số mạch DNA sẽ được nhân đôi. Nếu chu kỳ nhiệt lặp lại liên tục 30 – 40 lần thì số bản sao sẽ là 230 ~ 240 bản sao. Số lượng bản sao DNA khổng lồ này khi được gắn các phân tử phát tín hiệu (ví dụ Ethidium Bromide) có thể nhìn thấy bằng mắt thường trên gel điện di dưới ánh đèn UV
Kỹ thuật PCR
VẤN ĐỀ NGOẠI NHIỄM SẢN PHẨM PCR
Nguyên lý của PCR là khuếch đại DNA, vì vậy các phòng thí nghiệm sử dụng PCR liên tục không sớm thì muộn cũng sẽ bị nhiễm sản phẩm PCR lên tất cả các thiết bị, dụng cụ, hóa chất. Người làm thí nghiệm sẽ nhận ra được thảm họa này khi toàn bộ các lần chạy PCR đều ra dương tính, kể cả khi sử dụng mẫu là nước cất. Khi điều này xảy ra thì chỉ có cách bỏ toàn bộ hóa chất, khử nhiễm toàn bộ phòng thí nghiệm …. Dù vậy điều này vẫn sẽ tái diễn sau một khoảng thời gian sử dụng PCR.
Mọi thông tin các em liên hệ với thầy nhé :
phone: 0915.542.543
Facebook :
twitter:
Gmail : hiephoangphu@gmail.com
